顯微鏡—標(biāo)本制備和圖像采集

許多用于共聚焦顯微鏡的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，多以普通光學(xué)顯微鏡為基礎(chǔ)，必要時(shí)進(jìn)f?改進(jìn)以適合共日焦顯微鏡的需要。對(duì)于普通顯微鏡，主要方法是降低焦點(diǎn)以外的熒光干擾。與普通光學(xué)顯微鏡相比，事聚焦顯微鏡可進(jìn)行厚標(biāo)本深部的熒光觀察，對(duì)標(biāo)本的染色要求染色的時(shí)間較長(zhǎng)或熒光探針的濃度較高這對(duì)于普通光學(xué)顯微鏡可能造成染色過度，而無法分辨其細(xì)節(jié)。

典型的LSCM系統(tǒng)，盡管每秒掃撈多點(diǎn)，但其掃描強(qiáng)度大、亮度高。通常每點(diǎn)掃描時(shí)間為1。6p5對(duì)于每點(diǎn)的平均照明強(qiáng)度相對(duì)處于中等水平，比普通熒光顯微鏡低，對(duì)組織損傷小：許多實(shí)驗(yàn)技術(shù)使只丁抗光源白刑，可防止激光光束對(duì)熒光團(tuán)的光漂白作用。為防止激光對(duì)熒光探針的光漂白作用，盡可閉使用zui低強(qiáng)度的激光，現(xiàn)代的高水平LSCM，可以不使用抗光漂白劑。

顯微鏡—標(biāo)本制備和圖像采集

    LSCM的應(yīng)用，使得較厚切片的圖像質(zhì)量得到較大的改善。標(biāo)本必須*地適合顯微鏡的鏡臺(tái)，至觀察的區(qū)域應(yīng)當(dāng)在顯微鏡鏡頭的工作距離之內(nèi)。如高分辨串的60x，NA（數(shù)值孔徑）1．4的物鏡其工作距離為170μm；而凹x，NA o．75的物鏡其工作距離可達(dá)660μm。為觀察合適的區(qū)域，有時(shí)必須以損失分辨率為代價(jià)，否則，使用不適當(dāng)?shù)溺R頭，可能造成標(biāo)本被壓碎或損傷。

透光性和渾濁度可影響激光束的穿透深度，未固定和末染色的眼角膜上皮相當(dāng)透明，激光束可穿適深達(dá)200μm左友而對(duì)于未固定的皮膚組織，其穿透深度僅約為10Pμm，因?yàn)樗该鞫群懿睿馍⑸涠?lsquo;組織的作用就保中密度濾光片，可減弱激光束。在固定過程中加入某些透明刑可增加組織的透明度。

顯微鏡—標(biāo)本制備和圖像采集

激光能穿透較厚的標(biāo)本這一問題解決后，可用普通切片機(jī)切出較厚的切片，也可用振動(dòng)切片機(jī)制備恬體腑組織切片，在LSCM下，可獲得良好的標(biāo)記效果。為了觀察標(biāo)本深部也可將標(biāo)本從切片取下．佼其顛倒后再貼到切片上進(jìn)行觀察，從兩個(gè)方向觀察標(biāo)本。也可用長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)的熒光染料，如CY5來標(biāo)匯標(biāo)本較深部位的物質(zhì)，而不用短波長(zhǎng)激發(fā)的熒光染料標(biāo)記。與短波長(zhǎng)熒光染料標(biāo)記的圖像相比，其分辨率略有降低，但卻獲得了較強(qiáng)的穿透力。多光子LSCM，因?yàn)椴捎昧思t光作為激發(fā)光，則有利于從標(biāo)本的深部采集圖像。

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